Достижения

Лаборатория протеомики

Нанотераностика и персонифицированная наномедицина:

  • Для исследований в области генетической терапии злокачественных новообразований с помощью малых интерференционных РНК и наноматериалов (дендримеров) в 2013-2016 гг. Лабораторией совместно с зарубежными партнерами получен международный грант IRSES EU-Belarus-Russia Network in Nanomaterials-Driven Anti-Cancer Gene Therapy(’NANOGENE’) в рамках Седьмой Рамочной Программы Европейского союза. Участники: Кафедра общей биофизики, Лодзьский университет, г. Лодзь, Польша (координатор); Кафедра органической и неорганической химии, Университет г. Алкала, Алкала де Хенарес, Испания; Лаборатория иммуномолекулярной биологии, Госпиталь Грегорио Мараньена, Мадрид, Испания; Лаборатория координационной химии, Национальный центр научных исследований (CNRS), г. Тулуза, Франция; Институт химической биологии и экспериментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск, Россия; Лаборатория протеомики Института биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, Минск, Беларусь.

  • В содружестве с вышеуказанными партнерами проведен комплекс исследований по возможности применения карбосилановых и фосфорных дендримеров в качестве носителей антивирусных ОДН и миРНК, направленных против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). На первом этапе была изучена возможность комплексообразования между карбосилановыми дендримерами и анти-ВИЧ ОДН и миРНК методами флуоресценции, поляризации флуоресценции, флуоресцентных зондов, электронной микроскопии, зета-потенциала, зета-размера. Установлено, что взаимодействие между карбосилановыми и фосфорными дендримерами и анти-ВИЧ ОДН и миРНК приводит к формированию между ними комплексов, называемых дендриплексами. Комплексы характеризуются зарядовым соотношением 3:1 дендример-ОДН/миРНК и размерами 200-400 нм в зависимости от типа дендримера и ОДН/миРНК. Данные комплексы при использовании стабильного дендримера стабильны во времени в течение 48 часов, а в случае использования саморазрушающихся дендримеров – в течение 1-3 часов. Помимо этого, дендриплексы с миРНК были устойчивы к действию РНК-разрушающего фермента Рназы1. Формирование дендриплексов приводит к существенному снижению взаимодействия с альбуминами как ОДН/миРНК так и самих карбосилановых дендримеров. Анализ результатов по трансфекции дендриплексов в клетки показал, что при инкубации дендриплексов карбосилановых дендримеров с ати-ВИЧ ОДН наблюдается существенное (с 6000 до 1000 пикограмм на мл) снижение выхода p24 антигена (р24 антиген - белок, входящий в состав ядра ВИЧ; положительный результат анализа на антиген p24 говорит об активной репликации ВИЧ) в лимфобластных Т клетках MT-2 и мононуклеарных клетках периферической крови человека, что свидетельствует о высокой эффективности дендриплексов в снижении уровня размножения вируса ВИЧ в клетках. Применение дендриплексов с миРНК также приводило к снижению продукции вируса ВИЧ в мононуклеарных клетках периферической крови как при использовании миРНК против транскрипции белка NEF (белок Nef подавляет экспрессию рецепторов CD4 и анти­генов HLA класса I на поверхности ВИЧ-1-инфицированных клеток, и тем самым позволяет вирусу уклоняться от атаки цитотоксических T-лимфоцитов CD8 и от распознавания лимфоцитами CD4. Белок Nef может также угнетать активацию T-лимфоцитов, свя­зываясь с различными белками, участвующими в процессе внутриклеточной передачи сигнала), так и смеси различных миРНК.
  • Проведены модельные исследования по возможности связывания дендримерами различных веществ. С целью анализа связывающей способности дендримеров нами изучено взаимодействие между дендримерами (полиамидоаминные (ПАМАМ), фосфорные, полилизиновые, карбосилановые) и флуоресцентными зондами (АНС, дансил-амид, дансил-саркозин). В этих экспериментах флуоресцентные зонды использовались в качестве модельных токсинов. На основе полученных данных предложен способ оценки связывающей способности дендримеров. Данный способ основан на двойном флуориметрическом титровании и последующем анализе Скатчарда-Клотца кривых флуориметрического титрования зонда и дендримера. Исследование взаимодействия между сывороточным альбумином человека, флуоресцентным зондом АНС и ПАМАМ дендримером показало, что дендример может конкурировать с альбумином в процессе связывания зонда АНС. На основе полученных данных высказана гипотеза о возможности применения дендримеров для связывания эндогенных и экзогенных токсинов.
  • В развитие вышеуказанной гипотезы изучено взаимодействие ПАМАМ дендримеров с экзогенными и эндогенными токсинами методами флуоресценции, равновесного диализа, изотермальной титруемой калориметрии. В качестве экзогенных токсинов использовали ионы тяжелых металлов Cd2+ и Cs2+, в качестве эндогенных токсинов – билирубин, гиппуровая кислота, деоксихолевая кислота. Установлено, что полиамидоаминные дендримеры способны связывать ионы тяжелых металлов, что приводит к существенно меньшему влиянию таких комплексов на белки. Полученные данные свидетельствуют о возможности применения дендримеров для детоксикации при поражениях тяжелыми металлами. Показано, что полиамидоаминные дендримеры способны связывать билирубин и гиппуровую кислоту, что свидетельствует о возможности применения этих дендримеров в качестве связывающих агентов при повышении уровня билирубина при различных заболеваниях (гипербилирубинемия, гепатиты).
  • Проведен комплекс исследований по взаимодействию дендримеров с белками методами флуоресценции, поляризации флуоресценции, фосфоресценции, кругового дихроизма, изотермальной титруемой калориметрии, капиллярного электрофореза, зета-потенциала, электронного парамагнитного резонанса. Установлено, что влияние дендримеров на человеческий и бычий сывороточные альбумины зависит от ионной силы среды и рН раствора. Максимальный эффект наблюдался при низкой ионной силе и рН 7.4. Анализ взаимодействия между ПАМАМ дендримерами и альбумином (очищенным от жирных кислот, загруженным олеиновой кислотой, линолевой кислотой, олеиновой и линолевой кислотами, олеиновой, линолевой и арахидоновой кислотами) показал, что присутсвие жирных кислот существенно влияет на взаимодействие между дендримером и белком. При загруженности альбумина несколькими жирными кислотами добавление дендримера приводит к высвобождению жирной кислоты от белка и ее взаимодействию с дендримером. Полученные данные свидетельствуют о возможности регуляции уровня жирных кислот, переносимых альбумином в крови, с помощью дендримеров. Изучено взаимодействие между ПАМАМ дендримерами и белками гамма-глобулином, щелочной фосфатазой, азурином, альдолазой, РназойТ1, алкогольдегидрогеназой. Установлены различия в степени влияния дендримеров на белки в зависимости от их заряда, внутренней плотности и внутримолекулярной динамики. Показано, что активность ферментов в присутствии дендримеров может снижаться.
  • Проведены исследования по возможности использования полилизиновых дендримеров в качестве антимикробных агентов. Установлено, что полилизиновые дендримеры обладают антимикробной активностью против Грам-позитивных (Staphylococcus aureus) и Грам-негативных (Escherichia coli) бактерий, а также против грибных патогенов (Candida albicans). Подтверждением высокой антимикробной активности полилизиновых дендримеров могут служить результаты их влияния на жизнеспособность клеток фибробластов китайского хомячка и гемолиз эритроцитов человека: полилизиновые дендримеры существенно снижали жизнеспособность клеток фибробластов китайского хомячка и индуцировали 90-100% гемолиз эритроцитов, что указывает на их выраженное токсическое действие.

Информация о дендримерах

.

Протеомика: внутримолекулярная динамика и функциональная активность белков
Окислительный стресс и процессы перекисного окисления липидов в биологических системах

  • Установлен новый биофизический механизм регуляции активности протеома в норме и при патологи, реализующийся путем преобразований структурно-динамического состояния белков на фоне относительного постоянства их состава.
  • Предложена схема сопряжения между внутримолекулярной динамикой, конформацией и функциональной активностью белка. Установлено, что путем сдвигов внутримолекулярной динамики достигаются градуальные (плавные) изменения активности белка, а конформационные переходы обеспечивают возможность дискретного (ступенчатого) переключения режима его функционирования. Показано существование оптимальных для функционирования белка амплитуды и частоты равновесных движений структуры белка.
  • Предложена флуктуационная модель фермент-субстратных взаимодействий. В отличие от общепринятых моделей «ключ-замок» Фишера и «индуцированного соответствия» Кошланда, флуктуационная модель основана на учете роли внутримолекулярной динамики в процессах связывания субстрата активным центром фермента, дестабилизации ковалентных связей субстрата, высвобождения продуктов реакции.
  • Обнаружены новые механизмы действия на активность ферментов ионной силы и рН среды, реализующиеся посредством сдвигов медленной внутримолекулярной динамики белка.
  • Сформулирована и экспериментально обоснована концепция о возможности существования белка в нескольких термодинамически стабильных частично свернутых состояний, различающихся по глубине структурных преобразований и степени модификации функциональной активности.
  • Разработан новый метод изучения медленной (миллисекундной) внутримолекулярной динамики структуры мембранных белков in situ. Метод основан на регистрации кинетических параметров триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре белков. Создано приборное обеспечение метода – автоматизированные тау-фосфориметр и спектрофосфориметр.
  • Обнаружены контрастные различия медленной внутримолекулярной динамики периферических и интегральных белков эритроцитарных мембран. Установлено влияние белок-белковых и белок-липидных взаимодействий на медленную внутримолекулярную динамику мембранных белков.
  • Показано, что ограниченная по сравнению с большинством водорастворимых белков медленная внутримолекулярная динамика мембранных белков обусловлена повышенным содержанием в них жестких α-спиралей и β-структур, наличием белковых ассоциатов, изоляцией макромолекул от водного окружения в составе липидного бислоя.
  • Установлено, что изменения медленной внутримолекулярной динамики мембранных белков, наряду с их конформационными перестройками, играют важную роль в процессах внутриклеточной сигнализации и преобразования внешних сигналов (стимулов) в функциональные ответы клетки.
  • Обнаружена связь между изменениями медленной внутримолекулярной динамики мембранных белков клетки и развитием патологии. Выявлены разнонаправленные сдвиги структурно-динамического состояния мембранных белков лимфоцитов больных онкологическими и аутоиммунными заболеваниями. Установлено, что агрегация белков ткани хрусталика при катаракте сопряжена с ограничением внутримолекулярной динамики структуры макромолекул.
  • Разработан новый метод анализа продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических мембранах in situ. Метод основан на регистрации спектральных и кинетических параметров фосфоресценции при комнатной температуре продуктов ПОЛ. В отличие от существующих методов, фосфоресцентный метод позволяет осуществлять мониторинг накопления продуктов ПОЛ в различных участках биологических мембран.
  • Установлено, что в биологических мембранах накопление продуктов ПОЛ начинается локально в межбелковых участках липидного матрикса. В дальнейшем зона накопления продуктов ПОЛ расширяется и достигает аннулярных липидов. На следующей стадии продукты ПОЛ иммобилизуются на белках с образованием шиффовых оснований. Показано, что развитие патологии сопряжено с иммобилизацией продуктов ПОЛ на мембранных белках.
  • Проведен ингибиторный анализ механизмов действия сериновых протеаз (тромбин, трипсин, a-химотрипсин) в низких концентрациях на агрегационную активность тромбоцитов в условиях блокирования фосфолипазы С, циклооксигеназы, липооксигеназы и кальмодулин-зависимых ферментов. Показано, что продукты гидролиза фосфоинозитидов и метаболизма арахидоновой кислоты вовлечены в процессы агрегации тромбоцитов при действии сериновых протеаз.
  • Обнаружено, что способность к протеазо-индуцированной агрегации тромбоцитов беременных с гестозом снижается по сравнению с неосложненной беременностью. На основании выявленной закономерности разработан и внедрен в медицину «Способ определения степени тяжести гестоза» (патент BY 10282 С1 2008.02.28).
  • Предложено использовать трипсин в низких концентрациях для оценки функциональной активности тромбоцитов в норме и при патологии.

К началу страницы