Достижения

Лаборатория протеомики

Нанотераностика и персонифицированная наномедицина:

  • Для исследований в области генетической терапии злокачественных новообразований с помощью малых интерференционных РНК и наноматериалов (дендримеров) в 2013-2016 гг. Лабораторией совместно с зарубежными партнерами получен международный грант IRSES EU-Belarus-Russia Network in Nanomaterials-Driven Anti-Cancer Gene Therapy(’NANOGENE’) в рамках Седьмой Рамочной Программы Европейского союза. Участники: Кафедра общей биофизики, Лодзьский университет, г. Лодзь, Польша (координатор); Кафедра органической и неорганической химии, Университет г. Алкала, Алкала де Хенарес, Испания; Лаборатория иммуномолекулярной биологии, Госпиталь Грегорио Мараньена, Мадрид, Испания; Лаборатория координационной химии, Национальный центр научных исследований (CNRS), г. Тулуза, Франция; Институт химической биологии и экспериментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск, Россия; Лаборатория протеомики Института биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, Минск, Беларусь.

  • В 2016-2018 гг. проводятся исследования по международному гранту No. 19806/2016 “INNOVIMMUNE: Baltic Platform for Innovative Immunotherapies” c Каролинска университетом (Швеция), Рижским университетом (Латвия), Медуниверситетом им Пирогова (Россия).

  • Установлены биофизические механизмы взаимодействия дендримеров с белками. Показано, что связывание «дендример–белок» происходит преимущественно на поверхности белковой глобулы и определяется электростатическими взаимодействиями между заряженными группами дендримера и аминокислотными остатками белка. В зависимости от природы белковой макромолекулы взаимодействие затрагивает вторичную структуру белка, может менять его конформацию и внутримолекулярную. Установлены различия в степени влияния дендримеров на белки в зависимости от уровня жесткости структуры белковой макромолекулы (аспартат трансаминаза > лактат дегидрогеназа > щелочная фосфатаза). Показано, что дендример 4-ой генерации приводит к более существенному изменению вторичной структуры белков, чем дендример 3-ей генерации. Присутствие низких концентраций дендримера Г3 существенно влияет на конформацию лабильного фермента аспартат трансаминазы, при этом конформация фермента щелочная фосфатазы, обладающего жесткой структурой, остается практически неизменной. На основе результатов проведенных исследований высказана гипотеза о том, что интенсивность взаимодействия между дендримерами и белками определяется не только типом дендримера и видом его поверхностных групп, но и зарядом и жесткостью структуры белковой макромолекулы. Влияние дендримеров на конформацию и ферментативную активность белков зависит от природы концевых групп дендримера и жесткости структуры белковой макромолекулы.
  • Показано, что дендронизированные золотые наночастицы, как перспективные кандидаты для биомедицинского применения, способны существенно влиять на структурные и функциональные свойства белков плазмы крови - сывороточного альбумина человека и альфа-микроглобулина человека. Дендроны 2-ой и выше генераций, являющиеся структурными элементами дендримеров,, будучи присоединены к металлической поверхности золотых наночастиц, экранируют их от непосредственного взаимодействия с белками. В результате данного процесса, обнаружены несущественные изменения конформации и функциональной активности (иммунореактивности с антителами) белков плазмы крови после их взаимодействия с дендронизированными наночастицами золота 2й и 3й генераций.
  • Выявлены механизмы взаимодействия дендримеров с проапоптотическими миРНК (siBcl2, siBCl-xL, siMcl-1). Показано, что катионные ПАМАМ Г3, Г4 и карбосилановый NN16 дендримеры связываются с проапоптотическими миРНК siBcl2, siBCl-xL, siMcl-1, формируя комплексы с зарядовым соотношением 2–5/1 (+/–) и размерами 450-900 нм в зависимости от типа дендримера. Данные комплексы стабильны в присутствии РНКазы А и гепарина. Комплексы на основе дендримера и смеси из 3-х миРНК (коктейля) эффективно трансфецировались в раковые клетки HeLa и HL-60 и вызывали снижение их жизнеспособности в 1,2-1,4 раза. Таким образом, дендримеры могут служить носителями для проапототических миРНК, причем наиболее эффективными являются смеси (коктейли) из миРНК, направленных против различных мишеней, локализованных в злокачественных клетках. Комплексы дендримеров с миРНК могут быть использованы для разработки основ генной терапии злокачественных новообразований. Нами также установлено, что комплекс «миРНК-фосфорный дендример», добавляемый в клетки в малых концентрациях, существенно усиливает противораковое действие химиопрепарата 5-флуороурацила. Предложенный нами способ генной терапии злокачественных клеток на основе дендримеров и смесей (коктейлей) миРНК может лечь в основу разработки новых методов лечения злокачественных новообразований. В отличие от китайского препарата Гендицина, базирующегося на встраивающемся в геном человека рекомбинантном аденовирусе, миРНК, переносимые дендримерами, в принципе не способны встраиваться в ДНК клетки-мишени, в результате чего отсутствует опасность ошибочного изменения генома человека при попадании такого препарата в репродуктивные клетки и органы.

  • В содружестве с вышеуказанными партнерами проведен комплекс исследований по возможности применения карбосилановых и фосфорных дендримеров в качестве носителей антивирусных ОДН и миРНК, направленных против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). На первом этапе была изучена возможность комплексообразования между карбосилановыми дендримерами и анти-ВИЧ ОДН и миРНК методами флуоресценции, поляризации флуоресценции, флуоресцентных зондов, электронной микроскопии, зета-потенциала, зета-размера. Установлено, что взаимодействие между карбосилановыми и фосфорными дендримерами и анти-ВИЧ ОДН и миРНК приводит к формированию между ними комплексов, называемых дендриплексами. Комплексы характеризуются зарядовым соотношением 3:1 дендример-ОДН/миРНК и размерами 200-400 нм в зависимости от типа дендримера и ОДН/миРНК. Данные комплексы при использовании стабильного дендримера стабильны во времени в течение 48 часов, а в случае использования саморазрушающихся дендримеров – в течение 1-3 часов. Помимо этого, дендриплексы с миРНК были устойчивы к действию РНК-разрушающего фермента Рназы1. Формирование дендриплексов приводит к существенному снижению взаимодействия с альбуминами как ОДН/миРНК так и самих карбосилановых дендримеров. Анализ результатов по трансфекции дендриплексов в клетки показал, что при инкубации дендриплексов карбосилановых дендримеров с ати-ВИЧ ОДН наблюдается существенное (с 6000 до 1000 пикограмм на мл) снижение выхода p24 антигена (р24 антиген - белок, входящий в состав ядра ВИЧ; положительный результат анализа на антиген p24 говорит об активной репликации ВИЧ) в лимфобластных Т клетках MT-2 и мононуклеарных клетках периферической крови человека, что свидетельствует о высокой эффективности дендриплексов в снижении уровня размножения вируса ВИЧ в клетках. Применение дендриплексов с миРНК также приводило к снижению продукции вируса ВИЧ в мононуклеарных клетках периферической крови как при использовании миРНК против транскрипции белка NEF (белок Nef подавляет экспрессию рецепторов CD4 и анти­генов HLA класса I на поверхности ВИЧ-1-инфицированных клеток, и тем самым позволяет вирусу уклоняться от атаки цитотоксических T-лимфоцитов CD8 и от распознавания лимфоцитами CD4. Белок Nef может также угнетать активацию T-лимфоцитов, свя­зываясь с различными белками, участвующими в процессе внутриклеточной передачи сигнала), так и смеси различных миРНК.
  • Проведены модельные исследования по возможности связывания дендримерами различных веществ. С целью анализа связывающей способности дендримеров нами изучено взаимодействие между дендримерами (полиамидоаминные (ПАМАМ), фосфорные, полилизиновые, карбосилановые) и флуоресцентными зондами (АНС, дансил-амид, дансил-саркозин). В этих экспериментах флуоресцентные зонды использовались в качестве модельных токсинов. На основе полученных данных предложен способ оценки связывающей способности дендримеров. Данный способ основан на двойном флуориметрическом титровании и последующем анализе Скатчарда-Клотца кривых флуориметрического титрования зонда и дендримера. Исследование взаимодействия между сывороточным альбумином человека, флуоресцентным зондом АНС и ПАМАМ дендримером показало, что дендример может конкурировать с альбумином в процессе связывания зонда АНС. На основе полученных данных высказана гипотеза о возможности применения дендримеров для связывания эндогенных и экзогенных токсинов.
  • В развитие вышеуказанной гипотезы изучено взаимодействие ПАМАМ дендримеров с экзогенными и эндогенными токсинами методами флуоресценции, равновесного диализа, изотермальной титруемой калориметрии. В качестве экзогенных токсинов использовали ионы тяжелых металлов Cd2+ и Cs2+, в качестве эндогенных токсинов – билирубин, гиппуровая кислота, деоксихолевая кислота. Установлено, что полиамидоаминные дендримеры способны связывать ионы тяжелых металлов, что приводит к существенно меньшему влиянию таких комплексов на белки. Полученные данные свидетельствуют о возможности применения дендримеров для детоксикации при поражениях тяжелыми металлами. Показано, что полиамидоаминные дендримеры способны связывать билирубин и гиппуровую кислоту, что свидетельствует о возможности применения этих дендримеров в качестве связывающих агентов при повышении уровня билирубина при различных заболеваниях (гипербилирубинемия, гепатиты).
  • Проведен комплекс исследований по взаимодействию дендримеров с белками методами флуоресценции, поляризации флуоресценции, фосфоресценции, кругового дихроизма, изотермальной титруемой калориметрии, капиллярного электрофореза, зета-потенциала, электронного парамагнитного резонанса. Установлено, что влияние дендримеров на человеческий и бычий сывороточные альбумины зависит от ионной силы среды и рН раствора. Максимальный эффект наблюдался при низкой ионной силе и рН 7.4. Анализ взаимодействия между ПАМАМ дендримерами и альбумином (очищенным от жирных кислот, загруженным олеиновой кислотой, линолевой кислотой, олеиновой и линолевой кислотами, олеиновой, линолевой и арахидоновой кислотами) показал, что присутсвие жирных кислот существенно влияет на взаимодействие между дендримером и белком. При загруженности альбумина несколькими жирными кислотами добавление дендримера приводит к высвобождению жирной кислоты от белка и ее взаимодействию с дендримером. Полученные данные свидетельствуют о возможности регуляции уровня жирных кислот, переносимых альбумином в крови, с помощью дендримеров. Изучено взаимодействие между ПАМАМ дендримерами и белками гамма-глобулином, щелочной фосфатазой, азурином, альдолазой, РназойТ1, алкогольдегидрогеназой. Установлены различия в степени влияния дендримеров на белки в зависимости от их заряда, внутренней плотности и внутримолекулярной динамики. Показано, что активность ферментов в присутствии дендримеров может снижаться.
  • Проведены исследования по возможности использования полилизиновых дендримеров в качестве антимикробных агентов. Установлено, что полилизиновые дендримеры обладают антимикробной активностью против Грам-позитивных (Staphylococcus aureus) и Грам-негативных (Escherichia coli) бактерий, а также против грибных патогенов (Candida albicans). Подтверждением высокой антимикробной активности полилизиновых дендримеров могут служить результаты их влияния на жизнеспособность клеток фибробластов китайского хомячка и гемолиз эритроцитов человека: полилизиновые дендримеры существенно снижали жизнеспособность клеток фибробластов китайского хомячка и индуцировали 90-100% гемолиз эритроцитов, что указывает на их выраженное токсическое действие.

ПРОТЕОМИКА

1. Разработана концепция взаимодействия между световыми и гормональными сигнальными каскадами в растительной клетке и роли Са2+ и циклических мононуклеотидов как узловых элементов сигнальных систем.

2. Показано, что гуанилатциклазная сигнальная система, совместно с NO-синтазной и кальциевой сигнальными системами, участвует в формировании ответа растений на действие теплового, холодового и окислительного стресса, индуцируемого пероксидом водорода, а также опосредует закрывание устьиц клеток при водном дефиците, индуцированное абсцизовой кислотой, пероксидом водорода и оксидом азота. Предложена схема совместного действия основных сигнальных молекул, приводящего к закрыванию устьиц клеток.

3. Впервые показано, что при засолении трансдукция внутриклеточного сигнала полиаминов реализуется с участием цГМФ-зависимой сигнальной системы и опосредовано NO.

4. Впервые обнаружены различия в биохимических параметрах компонентов гуанилатциклазной системы (содержание цГМФ и фермента его синтеза гуанилатциклазы) в контрастных по устойчивости к абиотическим факторам (засуха, низкие температуры) сортах растений ячменя и в контрастных по устойчивости к биотическим факторам (патоген Phytophthora infestans) сортах растений томата.

5. Впервые показано, что специфичность клеточных ответов на действие циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) в клетках растений обусловлена связывающими центрами в белках-мишенях – компонентах цепей трансдукции жизненно важных регуляторных сигналов. Впервые цГМФ-связывающие белки из растений выделены и идентифицированы с помощью методов протеомики.

6. С помощью протеомного анализа установлен диагностический профиль экспрессии белков в растениях при окислительном стрессе.

7. С помощью протеомного анализа в плазме крови человека выявлен набор потенциальных маркерных белков рака молочной железы. С использованием метода микроэррей-анализа выявлены белки, уровень экспрессии генов которых отличается у пациенток с раком молочной железы по сравнению с донорами (здоровыми женщинами) и пациентками с фиброаденомой; а также белки, уровень экспрессии генов которых повышен в крови пациенток с фиброаденомой по сравнению с донорами, которые являются потенциальными маркерами предрасположенности к развитию доброкачественной опухоли молочной железы.

8. В плазме крови человека выявлен диагностический профиль белковой экспрессии при заболеваниях органов дыхания и, на его основе, предложен вспомогательный метод для проведения скринингового обследования пациентов при проведении медосмотра и с целью профотбора. Выявлены генотипы повышенного риска к развитию бронхолегочных и нейросенсорных заболеваний, что позволяет использовать данные гены в качестве маркеров для формирования групп риска при проведении предварительных и периодических медосмотров с целью профилактики патологий профессионального генеза. Метод апробирован ОАО «Беларуськалий» для скринингового обследования сотрудников комбината при проведении профессионального осмотра и с целью профотбора.

9. С использованием комбинации двумерного гель-электрофореза и масс-спектрометрического анализа установлено, что наноструктуры техногенного происхождения (многостенные железосодержащие углеродные нанотрубки и наночастицы серебра) приводят к значительным качественным изменениям протеома лимфоцитов крови человека, предложена тест-система для мониторинга биологического действия техногенных наноматериалов на организм человека.

10. С помощью протеомного анализа выявлены белковые маркеры мясной продуктивности сельскохозяйственных животных (свиней), предложен алгоритм протеомного диагностикума для определения продуктивных качеств особей свиней различных пород/помесей для селекции и определения качества мяса.

11. Впервые разработан лабораторный оптический биосенсор для определения глюкозы и пероксида водорода на основе тушения люминесценции оксида цинка. На примере данного биосенсора показано успешное использование наноструктурированного оксида цинка в качестве оптического датчика для обнаружения глюкозы.

Полученные результаты опубликованы в виде 1 коллективной монографии, 2 глав в англоязычных монографиях, 44 статей в ведущих научных журналах, 70 тезисов докладов на международных научных конференциях, 1 патента. Результаты исследований внедрены в учебный процесс кафедры экологического мониторинга факультета «Мониторинг окружающей среды» Международного государственного экологического университета им. А.Д. Сахарова БГУ, кафедры биохимии и биофизики факультета «Экологической медицины» Международного государственного экологического университета им. А.Д. Сахарова БГУ, кафедры биофизики физического факультета Белорусского государственного университета, кафедры физиологии и биохимии растений биологического факультета Белорусского государственного университета, в научный процесс кафедры генетики Белорусского государственного университета. Защищены 3 кандидатские диссертации, 4 магистерских диссертаций, 4 курсовые и 4 дипломные работы.

Информация о дендримерах

.

Протеомика: внутримолекулярная динамика и функциональная активность белков
Окислительный стресс и процессы перекисного окисления липидов в биологических системах

  • Установлен новый биофизический механизм регуляции активности протеома в норме и при патологи, реализующийся путем преобразований структурно-динамического состояния белков на фоне относительного постоянства их состава.
  • Предложена схема сопряжения между внутримолекулярной динамикой, конформацией и функциональной активностью белка. Установлено, что путем сдвигов внутримолекулярной динамики достигаются градуальные (плавные) изменения активности белка, а конформационные переходы обеспечивают возможность дискретного (ступенчатого) переключения режима его функционирования. Показано существование оптимальных для функционирования белка амплитуды и частоты равновесных движений структуры белка.
  • Предложена флуктуационная модель фермент-субстратных взаимодействий. В отличие от общепринятых моделей «ключ-замок» Фишера и «индуцированного соответствия» Кошланда, флуктуационная модель основана на учете роли внутримолекулярной динамики в процессах связывания субстрата активным центром фермента, дестабилизации ковалентных связей субстрата, высвобождения продуктов реакции.
  • Обнаружены новые механизмы действия на активность ферментов ионной силы и рН среды, реализующиеся посредством сдвигов медленной внутримолекулярной динамики белка.
  • Сформулирована и экспериментально обоснована концепция о возможности существования белка в нескольких термодинамически стабильных частично свернутых состояний, различающихся по глубине структурных преобразований и степени модификации функциональной активности.
  • Разработан новый метод изучения медленной (миллисекундной) внутримолекулярной динамики структуры мембранных белков in situ. Метод основан на регистрации кинетических параметров триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре белков. Создано приборное обеспечение метода – автоматизированные тау-фосфориметр и спектрофосфориметр.
  • Обнаружены контрастные различия медленной внутримолекулярной динамики периферических и интегральных белков эритроцитарных мембран. Установлено влияние белок-белковых и белок-липидных взаимодействий на медленную внутримолекулярную динамику мембранных белков.
  • Показано, что ограниченная по сравнению с большинством водорастворимых белков медленная внутримолекулярная динамика мембранных белков обусловлена повышенным содержанием в них жестких α-спиралей и β-структур, наличием белковых ассоциатов, изоляцией макромолекул от водного окружения в составе липидного бислоя.
  • Установлено, что изменения медленной внутримолекулярной динамики мембранных белков, наряду с их конформационными перестройками, играют важную роль в процессах внутриклеточной сигнализации и преобразования внешних сигналов (стимулов) в функциональные ответы клетки.
  • Обнаружена связь между изменениями медленной внутримолекулярной динамики мембранных белков клетки и развитием патологии. Выявлены разнонаправленные сдвиги структурно-динамического состояния мембранных белков лимфоцитов больных онкологическими и аутоиммунными заболеваниями. Установлено, что агрегация белков ткани хрусталика при катаракте сопряжена с ограничением внутримолекулярной динамики структуры макромолекул.
  • Разработан новый метод анализа продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических мембранах in situ. Метод основан на регистрации спектральных и кинетических параметров фосфоресценции при комнатной температуре продуктов ПОЛ. В отличие от существующих методов, фосфоресцентный метод позволяет осуществлять мониторинг накопления продуктов ПОЛ в различных участках биологических мембран.
  • Установлено, что в биологических мембранах накопление продуктов ПОЛ начинается локально в межбелковых участках липидного матрикса. В дальнейшем зона накопления продуктов ПОЛ расширяется и достигает аннулярных липидов. На следующей стадии продукты ПОЛ иммобилизуются на белках с образованием шиффовых оснований. Показано, что развитие патологии сопряжено с иммобилизацией продуктов ПОЛ на мембранных белках.
  • Проведен ингибиторный анализ механизмов действия сериновых протеаз (тромбин, трипсин, a-химотрипсин) в низких концентрациях на агрегационную активность тромбоцитов в условиях блокирования фосфолипазы С, циклооксигеназы, липооксигеназы и кальмодулин-зависимых ферментов. Показано, что продукты гидролиза фосфоинозитидов и метаболизма арахидоновой кислоты вовлечены в процессы агрегации тромбоцитов при действии сериновых протеаз.
  • Обнаружено, что способность к протеазо-индуцированной агрегации тромбоцитов беременных с гестозом снижается по сравнению с неосложненной беременностью. На основании выявленной закономерности разработан и внедрен в медицину «Способ определения степени тяжести гестоза» (патент BY 10282 С1 2008.02.28).
  • Предложено использовать трипсин в низких концентрациях для оценки функциональной активности тромбоцитов в норме и при патологии.

К началу страницы